Biotechnologies (STL) · Première · 8 – Déterminer la concentration d’une biomolécule dans un produit biologique
Doser par spectrophotométrie : la loi de Beer-Lambert
Plus c’est coloré, plus c’est concentré.
En bref
Plus une solution colorée est concentrée, plus elle absorbe la lumière.
Plus une solution colorée est concentrée, plus elle absorbe la lumière. La spectrophotométrie transforme cette observation en mesure précise de concentration.
La loi de Beer-Lambert
A = ε × ℓ × c
- A : absorbance (sans unité), mesurée à la longueur d’onde optimale ;
- ε : coefficient d’absorption molaire (L·mol⁻¹·cm⁻¹), propre à la molécule et à la longueur d’onde ;
- ℓ : longueur de la cuve traversée (souvent 1 cm) ;
- c : concentration (mol·L⁻¹).
À ℓ et λ fixés, l’absorbance est proportionnelle à la concentration. Cette proportionnalité n’est vérifiée que pour des solutions assez diluées (en pratique, souvent A < 1,5 à 2).
Chromophore et chromogène
- Un chromophore est coloré par lui-même : on le dose directement (colorant alimentaire, pigments chlorophylliens, ADN à 260 nm, protéines à 280 nm).
- Un chromogène est un produit coloré obtenu par réaction de la molécule à doser avec un réactif : c’est un dosage indirect.
Le dosage en point final
Quand la molécule n’est pas colorée, on la fait réagir totalement avec un réactif chimique (biuret pour les protéines) ou enzymatique (glucose oxydase-peroxydase pour le glucose) qui forme un chromogène. On attend la fin de la réaction (point final), puis on lit l’absorbance. On qualifie ainsi un dosage de chimique ou d’enzymatique selon la nature du réactif.
Le tableau de manipulation d’une gamme
| Tube | 0 (blanc) | 1 | 2 | 3 | 4 | Essai |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Solution étalon à 1,0 g·L⁻¹ (mL) | 0 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | — |
| Échantillon (mL) | — | — | — | — | — | 0,5 |
| Eau (mL) | 1,0 | 0,8 | 0,6 | 0,4 | 0,2 | 0,5 |
| Réactif (mL) | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 4,0 |
| Masse de soluté (mg) | 0 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | ? |
Tous les tubes ont le même volume total et le même volume de réactif : seule la quantité de soluté change. Le tube 0 sert à faire le zéro.
Exploiter
On trace A = f(masse ou concentration) : les points s’alignent sur une droite passant par l’origine. On lit l’essai sur la droite (ou on utilise son coefficient directeur), puis on remonte à la concentration de l’échantillon en tenant compte du volume prélevé et des dilutions.
Exemple travaillé
La droite d’étalonnage a pour équation A = 0,62 × m (m en mg). L’essai donne A = 0,31, donc m = 0,31 / 0,62 = 0,50 mg dans le tube. Cette masse provient de 0,5 mL d’échantillon : concentration = 0,50 mg / 0,5 mL = 1,0 mg·mL⁻¹ = 1,0 g·L⁻¹.
Les conditions opératoires
Respecter le temps de réaction, la température, la longueur d’onde, l’ordre d’ajout des réactifs ; utiliser la même cuve (ou des cuves appariées) ; placer l’essai dans le domaine de la gamme, sinon le diluer. Un étalon de contrôle vérifie l’exactitude de la série.
Teste-toi
6 questions pour vérifier
Touche une réponse : la correction s’affiche tout de suite.
1.Dans la loi de Beer-Lambert A = ε × ℓ × c, ℓ désigne…
2.À ℓ et λ fixés, l’absorbance est…
3.Un chromogène est…
4.ε = 1,0 × 10⁴ L·mol⁻¹·cm⁻¹, ℓ = 1 cm, A = 0,50. Concentration ?
5.Dans une gamme d’étalonnage, le tube 0 sert…
6.Le dosage du glucose par la glucose oxydase est un dosage…
0 / 6 questions
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