Biotechnologies (STL) · Première · 7 – Séparer les composants d’un mélange
Séparer par chromatographie : CCM et échange d’ions
Chaque molécule avance à son rythme.
En bref
Un produit biologique est un mélange. Pour identifier ses composants ou les récupérer, on les sépare.
Un produit biologique est un mélange. Pour identifier ses composants ou les récupérer, on les sépare. En première, on étudie les chromatographies.
Le principe commun
Toute chromatographie met en jeu deux phases :
- une phase fixe (stationnaire), qui retient les molécules : c’est la force de rétention ;
- une phase mobile, qui les entraîne : c’est la force d’entraînement.
Chaque molécule établit avec les phases des liaisons faibles différentes : celles qui sont peu retenues avancent vite, celles qui sont très retenues avancent lentement. Le mélange se sépare.
La chromatographie sur couche mince (CCM)
C’est une chromatographie analytique : elle sert à identifier.
- Tracer au crayon une ligne de dépôt à environ 1 cm du bas de la plaque (silice sur support).
- Déposer de petites taches du mélange et des étalons (molécules pures connues).
- Placer la plaque dans la cuve contenant un fond d’éluant (phase mobile), sous le niveau de la ligne de dépôt, et fermer.
- Retirer quand le front de l’éluant est à 1 cm du haut ; marquer ce front.
- Sécher et révéler (ninhydrine pour les acides aminés, réactif spécifique pour les sucres, lampe UV).
On calcule le rapport frontal :
Rf = distance parcourue par la tache / distance parcourue par le front de l’éluant. Il est compris entre 0 et 1 et, dans des conditions données, caractéristique d’une molécule.
On identifie une tache du mélange quand elle a le même Rf (même hauteur) qu’un étalon.
Exemple : front à 8,0 cm ; tache à 3,2 cm. Rf = 3,2 / 8,0 = 0,40.
Les points critiques de la CCM
- Dépôts trop gros : taches étalées qui se chevauchent.
- Ligne de dépôt sous le niveau de l’éluant : les dépôts se dissolvent dans la cuve.
- Cuve non saturée en vapeur ou couvercle ouvert : migration irrégulière.
- Composition de l’éluant : elle détermine la séparation.
- Une molécule en trop faible quantité peut passer sous la limite de détection : absence de tache ne signifie pas absence de molécule.
La chromatographie d’échange d’ions
C’est une chromatographie préparative : on veut récupérer les composants séparés. La phase fixe porte des charges (par exemple négatives, pour une résine échangeuse de cations) : les molécules de charge opposée s’y fixent par des liaisons ioniques.
- Fixation : on dépose le mélange ; les molécules de charge opposée à la résine s’accrochent.
- Lavage : on élimine ce qui ne s’est pas fixé.
- Élution : on change le pH ou la concentration en sel de la phase mobile pour détacher une à une les molécules retenues, et on recueille des fractions.
La charge d’un acide aminé dépend du pH : la lysine est positive à pH 7, l’acide glutamique négatif. Sur une résine chargée négativement à pH 7, la lysine est retenue, l’acide glutamique passe directement. On repère ensuite chaque fraction par un dépôt sur silice révélé à la ninhydrine, ou par une CCM.
Teste-toi
6 questions pour vérifier
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1.Dans une chromatographie, la phase mobile…
2.Front de l’éluant à 10,0 cm, tache à 6,0 cm. Rf ?
3.On identifie une tache du mélange quand elle a…
4.La ligne de dépôt d’une CCM se trace…
5.Pourquoi la ligne de dépôt doit-elle être au-dessus du niveau de l’éluant ?
6.La CCM est une chromatographie…
0 / 6 questions
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