Biochimie, biologie et biotechnologie (STL) · Terminale · T7 – Extraire, séparer, purifier les composants d’un mélange
Extraire, séparer et purifier les biomolécules
Du broyat à la protéine pure.
En bref
Pour étudier une enzyme, il faut d’abord la sortir de la cellule, puis l’isoler de milliers d’autres protéines.
Pour étudier une enzyme, il faut d’abord la sortir de la cellule, puis l’isoler de milliers d’autres protéines. Chaque étape exploite une propriété : la taille, la charge, la masse, l’affinité.
Fractionner un mélange hétérogène
- Broyage : casse les tissus et les cellules (foie de bœuf, radis, culot bactérien).
- Filtration : un filtre de porosité choisie retient les particules plus grosses que ses pores (rétentat) et laisse passer le reste (filtrat).
- Centrifugation : la rotation accélère la sédimentation ; les éléments denses forment le culot, le liquide au-dessus est le surnageant.
Toujours se demander : dans quelle fraction se trouve ce que je cherche ? On ne jette rien avant d’avoir vérifié.
L’électrophorèse
Des molécules chargées migrent dans un champ électrique, à travers un support (papier, gel d’agarose, gel de polyacrylamide) imprégné d’un tampon.
- Une molécule chargée négativement migre vers l’anode (+) ; positivement, vers la cathode (−).
- La charge d’une protéine ou d’un acide aminé dépend du pH du tampon : au-dessus de son pHi elle est négative, en dessous positive, à son pHi elle ne migre pas.
- En gel, pour l’ADN, les fragments migrent tous vers l’anode et se séparent selon leur taille : les petits vont plus loin.
- On compare les distances de migration à un marqueur de taille (ADN) ou de masse moléculaire (protéines), après révélation (colorant, agent intercalant).
Les chromatographies
Une phase mobile entraîne les molécules à travers une phase fixe ; chacune avance à sa vitesse.
| Chromatographie | Critère de séparation | Sortent en premier |
|---|---|---|
| Exclusion (gel filtration) | taille | les grosses molécules, qui n’entrent pas dans les pores |
| Échange d’ions | charge | les molécules de même charge que la résine ou neutres |
| Affinité | liaison spécifique à un ligand fixé | tout sauf la molécule cible, qu’on décroche ensuite |
Une chromatographie est analytique (identifier, contrôler) ou préparative (récupérer la molécule en quantité).
En exclusion, c’est l’inverse de l’électrophorèse d’ADN : les grosses molécules sortent avant les petites.
Suivre une purification d’enzyme
À chaque étape, on mesure le volume, la concentration en protéines et l’activité, puis on remplit un tableau :
Activité spécifique = activité totale / masse de protéines totales
Rendement = activité totale à l’étape / activité totale de départ × 100
Enrichissement (facteur de purification) = activité spécifique à l’étape / activité spécifique de départ
Une bonne étape augmente l’activité spécifique (on retire des protéines inutiles) en perdant le moins d’activité possible.
Exemple travaillé
Extrait brut : 200 U et 400 mg de protéines, soit 0,5 U·mg⁻¹. Après chromatographie : 120 U et 20 mg, soit 6 U·mg⁻¹. Rendement = 120 / 200 = 60 % ; enrichissement = 6 / 0,5 = 12. On a perdu 40 % de l’enzyme, mais elle est 12 fois plus pure.
Teste-toi
6 questions pour vérifier
Touche une réponse : la correction s’affiche tout de suite.
1.Après centrifugation, les éléments les plus denses se trouvent dans…
2.Ce qui est retenu par un filtre s’appelle…
3.Dans un tampon de pH supérieur à son pHi, une protéine migre…
4.En électrophorèse sur gel d’agarose, les fragments d’ADN se séparent selon…
5.En chromatographie d’exclusion, sortent en premier…
6.La chromatographie d’affinité exploite…
0 / 6 questions
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La fiche de révision, sur une page
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