Dosages enzymatiques : point final et activité enzymatique

Au laboratoire d’analyses, la glycémie se dose avec des enzymes, et l’activité d’enzymes du sang signale une maladie du foie. Deux dosages, deux logiques : l’enzyme est tantôt un outil, tantôt la cible.

Doser un substrat en point final

On veut la concentration d’un substrat (glucose, par exemple). On ajoute les enzymes en excès : tout le substrat est transformé, la réaction va à son terme, le point final. On mesure alors un produit coloré.

Souvent, plusieurs réactions sont couplées :

Exemple : la méthode GOD-POD.

Glucose + O₂→(glucose oxydase, GOD)→acide gluconique + H₂O₂

2 H₂O₂ + chromogène→(peroxydase, POD)→chromophore rose + 4 H₂O

Le substrat à doser est la molécule limitante ; les enzymes et les autres réactifs sont en excès.

→On établit la stœchiométrie entre le substrat et la molécule indicatrice : ici, 1 glucose donne 1 H₂O₂ ; il faut 2 H₂O₂ pour 1 chromophore, donc 2 glucoses pour 1 chromophore.

Étalon unique ou gamme

Le chromophore obéit à la loi de Beer-Lambert (A = ε × ℓ × c).

• ✱Gamme d’étalonnage : plusieurs étalons, une droite A = f(c), sur laquelle on lit la concentration de l’essai.
• ✱Étalon unique : si la linéarité est connue, c(essai) = c(étalon) × A(essai) / A(étalon).

On établit d’abord le tableau de manipulation (volumes de chaque tube, blanc, étalons, essais) à partir du mode opératoire.

Doser une activité enzymatique

Ici on veut la quantité d’enzyme active dans un échantillon (sérum, lait). Le substrat est cette fois en excès (saturant), l’enzyme est limitante.

• ✱Activité enzymatique z : quantité de substrat transformée par unité de temps, en katal (mol·s⁻¹) ou en U (µmol·min⁻¹).
• ✱Concentration d’activité b : activité par unité de volume d’échantillon (U·L⁻¹ ou kat·L⁻¹).

1 U = 1 µmol·min⁻¹ ≈ 16,67 nkat

Mesurer la vitesse initiale

On suit l’absorbance en fonction du temps :

• ✱Cinétique en continu : on mesure A à intervalles réguliers ; on garde la période initiale, où la courbe est linéaire ; sa pente ΔA/Δt donne la vitesse.
• ✱Méthode deux points : on mesure A à deux instants seulement, en s’assurant qu’ils sont dans la période initiale.

La température (thermostatisation) et le pH (tampon) sont fixés au plus près de l’optimum, car l’activité en dépend.

!Hors de la période initiale, la vitesse chute et l’activité est sous-estimée.

Exemple travaillé

Phosphatase alcaline du lait : ΔA/Δt = 0,050 min⁻¹ à 405 nm, ε = 18 500 L·mol⁻¹·cm⁻¹, ℓ = 1 cm, volume réactionnel 3,0 mL, prise d’essai 0,10 mL.

• ✱Vitesse : 0,050 / 18 500 = 2,7 × 10⁻⁶ mol·L⁻¹·min⁻¹, soit 2,7 µmol·L⁻¹·min⁻¹ dans la cuve.
• ✱Dans 3,0 mL : 8,1 × 10⁻³ µmol·min⁻¹, apportés par 0,10 mL de lait.
• ✱b = 8,1 × 10⁻³ / 0,10 × 10⁻³ ≈ 81 U·L⁻¹.